|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
Пробиотики подавляют вирусную активность
30.11.2021 17:07
 Viruses 2021, 13, 2227. https://doi.org/10.3390/v13112227 www.mdpi.com/journal/viruses
Статья Способность эко-устойчивой очистки пробиотиками снижать инфекционность оболочечных вирусов Мария Д’Аккольти1,2, Ирене Соффритти1,2, Франческо Бонфанте3, Вальтер Риччарди4, Санте Мадзакане2 и Элизабетта Казелли1,2,*
1 Section of Microbiology, Department of Chemical, Pharmaceutical and Agricultural Sciences, LTTA, 2 CIAS Research Center, University of Ferrara, Via Saragat 13, 44122 Ferrara, Italy; sante.mazzacane@unife.it 3 Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, IZSVe, Viale dell’Universita 10, 35020 Legnaro, Italy; fbonfante@izsvenezie.it 4 Faculty of Medicine and Surgery, Universita Cattolica del Sacro Cuore, Largo Francesco Vito 1, 00168 Roma, Italy; walter.ricciardi@unicatt.it * Контактный адрес: csb@unife.it
Аннотация. Пандемия COVID‐19 глубоко повлияла на методики обеззараживания: чтобы предотвратить распространение SARS‐CoV‐2, массово стала использоваться дезинфекция высокого уровня, которая может иметь негативные последствия для окружающей среды и усилить угрозу устойчивости к противомикробным препаратам (УПП). Стремясь решить эти проблемы, сохранив при этом эффективность обеззараживания от оболочечных вирусов, мы провели оценку противовирусных характеристик системы очистки пробиотиками (СОПР) (Probiotic Cleaning Hygiene System, PCHS), основанной на применении эко-устойчивых пробиотических моющих средств, с уже доказанной способностью стабильно снижать загрязнение патогенными микроорганизмами и УПП. Средство СОПР (в разведениях 1:10, 1:50 и 1:100) протестировали в сравнении с обычными дезинфектантами (70 % этиловый спирт и 0,5 % гипохлорит натрия), проведя испытания суспензии и поверхностные испытания в соответствии с европейскими стандартами UNI EN 14476:2019 и UNI EN 16777:2019. В исследование были включены альфа‑ и бета-коронавирусы человека hCoV‐229E и SARS‐CoV‐2, вирус герпеса человека 1 типа, вирусы гриппа человека и животных, а также вирус осповакцины. Результаты показали, что СОПР позволяет инактивировать 99,99 % всех тестовых вирусов в течение 1–2 ч контакта как в суспензии, так и на поверхности. Примечательно, что если действие контрольных дезинфектантов заканчивалось в течение 2 ч после их применения, то противовирусный эффект СОПР сохранялся до 24 ч после применения. Это показывает, что использование данной системы может эффективно обеспечить постоянную профилактику распространения вирусов через загрязненную окружающую среду, не оказывая негативного воздействия на загрязнение окружающей среды и не усугубляя проблему УПП.
Ключевые слова: обеззараживание от оболочечных вирусов, инактивация SARS‐CoV‐2, профилактика, инфекционный контроль, экологически безвредная дезинфекция.
1. Введение Пандемия COVID‐19, вызванная новым коронавирусом человека SARS‐CoV‐2, глубоко повлияла на привычки в области гигиены и обеззараживания, высветив риск, связанный с вирусным загрязнением окружающей среды, особенно в больницах. COVID‐19 фактически распространился по всему миру и на данный момент стал причиной свыше 244 миллионов подтвержденных случаев заболевания и 4,96 миллиона смертей [1]. Инфекция SARS‐CoV‐2 в основном передается респираторно капельным путем; вместе с тем сообщалось, что на неживых твердых поверхностях, по крайней мере в контролируемых лабораторных условиях, вирус сохраняется до нескольких дней [2,3], а это значит, что непосредственный контакт с поверхностями и предметами, загрязненными каплями или другими жидкостями организма, может способствовать передаче инфекции [4–9]. Хотя передачу через предметы трудно доказать бесспорно [10], было зарегистрировано несколько таких случаев [11,12] и был оценен риск заражения, связанный с возможным переносом инфекции с рук на предмет [8,13,14]. Исходя из этих данных, ВОЗ предложила меры профилактики, а регулирующие органы ввели обязательное использование вирулицидных химических дезинфектантов высокого уровня для очистки поверхностей в помещениях (включая медицинские и немедицинские учреждения) в качестве временных рекомендаций по борьбе с чрезвычайной ситуацией в области здравоохранения, связанной с COVID‐19 [10,15]. Однако, с учетом наблюдений на других микроорганизмах, эффект от применения дезинфектантов может быть временным и не сможет предотвратить повторное загрязнение, которое происходит постоянно из-за постоянного распространения его людьми в замкнутом пространстве [16]. Несмотря на первоначальную быструю инактивацию микроорганизмов, обеззараженные поверхности вскоре могут подвергнуться повторному загрязнению и потенциально стать новым источником передачи инфекции. Кроме того, чрезмерное использование дезинфицирующих средств может представлять угрозу для людей [17], и есть разные мнения о необходимости применения дезинфектантов вместо чистящих средств, особенно в среде медицинских учреждений с низким риском и в немедицинской среде [18,19]. Наконец, массовое использование дезинфектантов может иметь негативные последствия для городской среды и живой природы [20], а также для водных экосистем [21]. Было доказано, что некоторые химические соединения, применяемые для дезинфекции, вызывают селекцию или индуцирование устойчивости к противомикробным препаратам (УПП) у патогенных микроорганизмов, включая те, которые, как известно, оказывают существенное влияние на клиническое лечение COVID-19 [22] [23–25]. Принимая во внимание тот факт, что УПП микроорганизмы могут затруднить лечение пациентов с COVID‐19, а сама УПП уже убивает миллионы людей каждый год (свыше 37 000 человек в одном только Европейском Союзе), очевидно, что дальнейшее распространение УПП может усугубить последствия будущих пандемий. Поэтому срочно необходимы простые, эффективные, щадящие и, по возможности, недорогие методики, позволяющие обеспечить длительное обеззараживание обработанных поверхностей и при этом лишенные побочных эффектов, связанных с химической дезинфекцией. Помимо SARS‐CoV‐2, способность сохранять инфекционность на твердых поверхностях в течение длительного времени, в зависимости от типа вируса, характеристик поверхностей, температуры и влажности, продемонстрировали и некоторые другие оболочечные вирусы [26], включая коронавирусы и вирусы гриппа и герпеса человека [27–29]. Сообщалось также, что вирусы парагриппа, гепатита B и C, а также HIV‐1 сохраняются на поверхностях и загрязненных предметах [30], которые могут представлять собой вирусные резервуары и векторы передачи вирусов восприимчивым людям [28,31]. Принимая во внимание опубликованные данные о присутствии и сохранении вирусов в больничной среде [30,32,33], которые показывают теоретический риск передачи вирусов госпитализированным пациентам, стратегии профилактики и контроля инфекций предусматривают, как часть этого процесса, санитарно-гигиеническую обработку окружающей среды. Следует отметить, что до недавнего времени вирусный компонент больничного микробиома в стратегиях мониторинга, направленных на борьбу с возникновением в клинических условиях инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП), в отличие от бактериальных и грибковых инфекций не рассматривался, хотя риск вирусного заражения, даже если он минимальный, существует. К числу вирусов, способных передаваться через загрязненную среду, относятся коронавирусы человека (оболочечные одноцепочечные РНК-вирусы с положительной цепью), которые могут вызывать от легких до тяжелых респираторных инфекций [34] и могут сохраняться на неживых поверхностях разного типа, оставаясь контагиозными при комнатной температуре от 2 часов до 9 дней [3][4]. Аналогичным образом, вирусы гриппа (оболочечные одноцепочечные РНК-вирусы с отрицательной цепью), среди которых самым заразным из четырех типов является вирус гриппа типа А [35], могут сохранять инфекционные свойства на гладких поверхностях до 48 часов [36,37], а штамм H5N1 может выживать на стекле и стали при низкой относительной влажности и температуре более 13 дней [38]. Вирус простого герпеса человека 1 типа (HSV‐1, оболочечный двухцепочечный ДНК-вирус), возбудитель орального и генитального герпеса, способен сохраняться на сухих неживых поверхностях от нескольких часов до одной недели [28], а его передача может вызывать широкий спектр инфекционных заболеваний, от легких до опасных для жизни у людей с незрелым иммунитетом или у пациентов с ослабленным иммунитетом [39]. Учитывая способность многих вирусов сохранять инфекционные свойства на неживых поверхностях, контроль вирусного загрязнения окружающей среды – это ключевой вопрос, требующий решения. В действующих руководствах по ведению случаев COVID‐19 для санитарной обработки рекомендуется использовать дезинфектанты высокого уровня, обычно 0,1–0,5 % гипохлорита натрия (NaClO) и 1 % перекись водорода (H2O2) [40]. Однако, несмотря на их быстродействие [41], они не гарантируют длительный эффект для стабильного поддержания обеззараженной среды. Скорее, судя по данным, ранее опубликованным нами и другими авторами [16,42–44], обеззараженная среда может быстро подвергнуться повторному загрязнению, что приведет к постоянному загрязнению в течение большей части дня. Стремясь найти эффективную методику долгосрочной очистки, обеспечивающую стабильное снижение вирусного загрязнения и не влияющую на загрязнение окружающей среды и УПП, мы протестировали противовирусные свойства эко-устойчивой системы очистки пробиотиками (СОПР) (Probiotic Cleaning Hygiene System, PCHS), которая, как было доказано ранее, предотвращает повторное загрязнение патогенными микроорганизмами за счет ремодуляции больничного микробиома. Эта система, действие которой основано на биологических свойствах специально отобранных видов пробиотических Bacillus, входящих в состав экологически безвредных моющих средств, стабильно уменьшает количество резистентных патогенов (–80 %) [16,22,45–48] и связанных с ними инфекций (−52 %) [44,46], а также оказывает соответствующее положительное воздействие на потребление антимикробных препаратов (−60 %) и затраты на лечение (−75 %) [46]. Опираясь на эти наблюдения, мы оценили противовирусную эффективность СОПР в отношении различных оболочечных вирусов, известных своей способностью длительно сохраняться на поверхностях, а именно: коронавирусов человека hCoV‐229E и SARS-CoV‐2, HSV‐1, вирусов гриппа типа А человека (H3N2 человека) и животных (H10N1 птиц и H1N2 свиней) и модифицированного вируса осповакцины Анкара (MVA), который является наиболее резистентным среди оболочечных вирусов и поэтому обязательно включается в стандартные европейские методики, используемые для оценки противовирусных свойств дезинфицирующих средств. Анализ проводился in vitro в соответствии с европейскими стандартами проведения испытаний суспензии и поверхностных испытаний [49], чтобы протестировать обеззараживающее и профилактическое действие СОПР в сравнении со стандартными дезинфектантами.
2. Материалы и методы 2.1. Пробиотическое моющее средство Система очистки пробиотиками (СОПР) (Copma Scrl, Феррара, Италия), использованная во всех испытаниях, ранее была описана в [22]. Она предусматривает применение получивших маркировку EU Ecolabel (https://eur‐lex.europa.eu/legal‐content/EN/TXT/?uri=CELEX:32010R0066, дата доступа 23 октября 2021 г.) моющих средств, содержащих 107 КОЕ/мл спор специально отобранных пробиотических микроорганизмов класса Bacillus (а именно, видов B. subtilis, B. pumilus и B. megaterium). СОПР была протестирована при разведении моющего средства в стерильной дистиллированной воде в соотношениях 1:10, 1:50 и 1:100.
2.2. Вирусы и клетки Оболочечные вирусы и соответствующие клетки-мишени, использованные для приготовления вирусных инокулятов, методы титрования вирусов и стандартные методы анализа инактивациии приведены в Табл. 1.
Таблица 1. Штаммы вирусов и клетки-мишени, использованные в анализе
1 Предоставлен Институтом вирусологии и иммунологии Бернского университета, Швейцария. 2 Предоставлен Экспериментальным зоопрофилактическим институтом Венеции, Падуя, Италия.
Клетки MRC‐5 культивировали в минимальной питательной среде Игла (Eagle Minimal Essential Medium, EMEM) (Gibco, Гранд-Айленд, Нью-Йорк), а остальные клеточные линии – в минимальной питательной среде Дульбекко (Dulbecco Minimal Essential Medium, DMEM) (Gibco, Гранд-Айленд, Нью-Йорк). Все клеточные линии выращивали при 37 °C + 5 % CO2 в соответствующей питательной среде с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L‐глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (полная питательная среда) (Gibco, Гранд-Айленд, Нью-Йорк). Исходный вирусный материал получали путем инфицирования определенных клеток-мишеней с конфлюэнтностью 90 %, с последующей инкубацией их при соответствующей температуре (35 °C для hCoV‐229E и 37 °C для всех остальных вирусов) + 5 % CO2 в питательной среде, в которую был добавлен 2 % FBS. Зараженные клеточные культуры инкубировали в течение разного времени до проявления цитопатического действия (ЦПД), охватывающего >80 % культивированных клеток, что соответствовало 2 суткам для MVA и HSV‐1, 5 суткам для SARS‐CoV‐2, 3 суткам для вирусов гриппа и 7 суткам для hCoV‐229E. По окончании инкубационного периода клетки и культуральные супернатанты собирали. Клетки лизировали посредством 3 циклов быстрого замораживания в жидком азоте и размораживания при 37°C, которые чередовали при помощи 30‑секундного импульсного вортекса. После этого клеточный лизат добавляли в культуральный супернатант и выделяли вирусные частицы центрифугированием при 20 000 x g в течение 45 мин при 4°C. Вирусные осадки суспендировали в 1 мл PBS + 1 % альбумине бычьей сыворотки (BSA), затем замораживали и хранили при −80 °C до использования. Титр исходного вирусного материала определяли путем инфицирования соответствующих клеток-мишеней, высеянных в 96‐луночные планшеты, используя те же условия культивирования, что и для приготовления исходного вирусного материала, и определяя цитопатогенную дозу, инфицирующую 50 % клеток (TCID50), в расчете на 1 мл по стандартному методу Спирмена–Кербера, ранее описанному в [50,51]. Коротко говоря, серийные разведения вирусных инокулятов добавляли к взятым в двух экземплярах образцам клеток-мишеней, высеянных в 96‐луночные планшеты, и по истечении соответствующего времени инкубации регистрировали ЦПД. Титр вируса рассчитывали по следующей формуле, чтобы непосредственно оценить концентрацию, при которой наблюдается 50 %‑й эффект. (1) Log ID50 = Log (максимальное разведение, обеспечивающее 100 % ЦПД) + 0,5 _ __общее число лунок, в которых наблюдается ЦПД __ число лунок, приходящихся на каждое разведение
Согласно расчетам по методу Спирмена–Кербера, Весь исходный вирусный материал содержал примерно 108 TCID50/мл.
2.3. Противовирусная активность: испытания суспензии Противовирусную активность СОПР в суспензии проверяли по стандартной европейской методике UNI EN 14476:2019, как предписано Техническим комитетом 216 (TC216) «Средства дезинфицирующие химические и антисептики» Европейского комитета по стандартизации, который разрабатывает методы испытаний эффективности дезинфицирующих средств в Европе с 1989 года [49,52]. Коротко говоря, 10 мкл суспензии исходного вирусного материала (что соответствует 105–107 TCID50, в зависимости от вида вируса) добавляли к 90 мкл разведенного в соответствующей пропорции (1:10, 1:50 и 1:100) средства СОПР в присутствии 0,3 % BSA, чтобы имитировать условия, которые встречаются на больничных поверхностях («чистые» условия). В качестве негативного и позитивного контроля использовали питательную среду и 70 % этанол (EtOH). Суспензию инкубировали при комнатной температуре в течение 1, 2, 4, 8 и 24 ч; после этого ее собирали, сразу же разводили в 0,9 мл холодной среды + 2 % FBS (этап нейтрализации), отфильтровывали (0,45 мкм) для удаления пробиотического компонента, а затем серийно разводили (10‐кратное разведение) в холодной среде + 2 % FBS для определения остаточного титра вируса по методу Спирмена–Кербера. Затем инфицированные клетки инкубировали при соответствующей температуре в присутствии 5 % CO2 в течение времени, необходимого для проявления ЦПД вируса. Репрезентативные изображения ЦПД представлены в дополнительных материалах на рис. S1. Инфекционный титр выражали в TCID50/мл. Каждый вариант условий эксперимента оценивали дважды, а полученные результаты представляются собой средние значения трех независимых испытаний. Все эксперименты с SARS‐CoV‐2 проводили в лаборатории с уровнем биобезопасности 3 (BSL‐III). Экспериментальный контроль и оценку цитотоксичности средств СОПР и стандартных дезинфектантов проводили на всех типах клеток, используемых в анализе, в соответствии с протоколом стандартных методик.
2.4. Противовирусная активность: поверхностные испытания Противовирусную активность средств СОПР на твердых непористых поверхностях оценивали по стандартной европейской методике UNI EN 16777:2019 [53] с использованием MVA и hCoV-229E в качестве целевых вирусов. По правилам, оценки следует проводить на загрязненных участках поверхности из нержавеющей стали диаметром 2 см в трех разных вариантах условий для оценки соответственно: (1) способности средств СОПР обеззараживать ранее загрязненные вирусами поверхности; (2) краткосрочной способности поверхностей, обработанных средствами СОПР, инактивировать последующее вирусное загрязнение; (3) долгосрочного действия средств СОПР по стабильному предотвращению последующего вирусного загрязнения. Каждый из тестов проводили в присутствии 0,3 % BSA как органической нагрузки («чистые» условия). Коротко говоря, при тестировании обеззараживания 100 мкл вирусного инокулята (соответствующего 106 TCID50) высеивали на несущую поверхность с помощью микропипетки, размазывали каплю по поверхности диаметром примерно 1 см и оставляли сохнуть при комнатной температуре; затем сразу же наносили поверх нее 100 мкл средства СОПР, предварительно разведенного в воде в соотношениях 1:10, 1:50 и 1:100. Для позитивного и негативного контроля использовали соответственно 70 % EtOH и питательную среду. Через 1, 2, 4, 8 и 24 ч добавляли 0,9 мл (10‐кратное разведение) ледяной среды + 2 % FCS (фетальной телячьей сыворотки), чтобы собрать остаточный вирус. Собранную среду затем отфильтровывали (0,45 мкм) для удаления пробиотического компонента и серийно разводили (в 10 раз) в холодной среде + 2 % FCS. Каждое разведение переносили в 96‑луночные микропланшеты (0,1 мл/лунка), содержащие монослой клеток с 90 % конфлюэнтностью, которые затем инкубировали при соответствующих условиях для определения остаточного титра вируса по методу Спирмена–Кербера. При тестировании способности предотвращать вирусное загрязнение 100 мкл средства СОПР в разведениях 1:10, 1:50 и 1:100 высеивали на поверхность и оставляли сохнуть при комнатной температуре. Для позитивного и негативного контроля использовали соответственно 70 % EtOH и питательную среду. Сразу же после высыхания поверхности инфицировали 100 мкл вирусного инокулята (106 TCID50). Через 1, 2, 4, 8 и 24 ч отбирали пробы и титровали их, как описано для теста на обеззараживание. Долгосрочную способность средств СОПР предотвратить вирусное загрязнение анализировали, высеивая 100 мкл средства СОПР в разведениях 1:10, 1:50 и 1:100 на поверхность, а затем, через 1, 2, 4, 8 и 24 ч, инфицируя обработанную поверхность 100 мкл вирусного инокулята (106 TCID50). Для позитивного контроля использовали 70 % EtOH и 0,5 % гипохлорит натрия (NaClO), а для негативного контроля – питательную среду. Вирусный инокулят оставляли на 2 ч, а затем собирали и титровали, как описано для предыдущих тестов. Экспериментальный контроль и оценку цитотоксичности средств СОПР и стандартных дезинфектантов проводили на всех типах клеток, используемых в анализе, в соответствии с протоколом стандартных методик. EtOH и NaClO оказались цитотоксичными при разведении 10−1 на всех использованных клеточных линиях, тогда как средство СОПР не продемонстрировало клеточной токсичности, поэтому непосредственное сравнение титра вирусов проводили при разведениях 10−2 и выше.
2.5. Анализ ферментативной активности пробиотических микроорганизмов Виды Bacillus в составе моющих средств, используемых в системе СОПР (а именно, B. subtilis, B. pumilus и B. megaterium), ранее выделенные в культуре, оценивали по системе API‐ZYM (BioMerieux, Флоренция, Италия) на их способность продуцировать ферменты, потенциально полезные для разрушения вирусных компонентов, в соответствии с инструкциями производителя.
2.6. Статистический анализ Статистический анализ проводили с использованием программного пакета Agilent GeneSpring GX v11.5 (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США) и R (R 2019, R Core Team, программное обеспечение можно загрузить бесплатно по адресу https://www.r.project.org/, дата доступа 10 мая 2021 г.) по t‐критерию Стьюдента. Значимость принимали на уровне p <0,05.
3. Результаты 3.1. Противовирусная активность средств СОПР в суспензии Результаты оценки противовирусной активности средств СОПР в отношении указанных оболочечных вирусов в условиях суспензии (по стандартной европейской методике UNI EN 14476:2019) показывают, что система СОПР может эффективно инактивировать все тестовые вирусы, независимо от их вида (Рис. 1), включая MVA – единственный оболочечный вирус, который обязательно включается в стандартные руководства и считается наиболее резистентным среди вирусов в оболочке. В частности (Рис. 1A), более высокие концентрации средства СОПР в течение 1 ч контакта привели к уровню инактивации MVA >4 Log (−6.1 и −5.1 Logs для разведений 1:10 и 1:50 соответственно), а разведение 1:100 в течение 1 ч обеспечило уровень инактивации –2,7 Log, который в течение 2 ч уменьшился до >4 Log (–4,3 Log), что соответствует нормам стандарта UNI EN 14476:2019, устанавливающим требования к минимальной эффективности средства с противовирусной активностью в отношении определенного вида вирусов. Снижение инфекционного титра вируса увеличивалось в зависимости от времени при дальнейшем увеличении периода инкубации (4, 8 и 24 ч).
Титр вируса (Log10 TCID50/мл) Время контакта A) MVA B) HSV-1 C) hCoV-229E D) SARS-CoV-2 E) HIN2 свиней H2N2 человека H10N1 птиц Рис. 1. Противовирусная активность средств СОПР в отношении указанных оболочечных вирусов в испытаниях суспензии. (A) Титр модифицированного вируса осповакцины (MVA) после контакта со средством СОПР в указанных разведениях, определенный в клетках-мишенях BHK. (B) Титр вируса HSV‐1 после контакта со средством СОПР в указанных разведениях, определенный в клетках-мишенях Vero. (C) Титр вируса hCoV‐229E после контакта со средством СОПР в указанных разведениях, определенный в клетках-мишенях MRC‐5. (D) Титр вируса SARS‐CoV‐2 после контакта со средством СОПР (разведение 1:100), определенный в клетках-мишенях Vero. (E) Титры вирусов гриппа человека и животных после контакта со средством СОПР в разведении 1:100 для штаммов гриппа свиней H1N2, гриппа человека H3N2 и гриппа птиц H10N1; остаточный титр вируса определяли в клетках-мишенях MDCK. Для позитивного контроля инактивации вирусов в каждом тесте использовали 70 % EtOH. Результаты выражены как Log10 TCID50/мл и представлены как среднее значение ± стандартное отклонение для параллельных проб в трех независимых испытаниях для каждого вида вирусов.
На Рис. 1B представлены результаты в отношении HSV‐1, которые подтвердили и расширили результаты, полученные в отношении MVA. Действительно, в течение 1 ч контакта уровень инактивации вирусов >4 Log наблюдался при любом разведении средства СОПР. Сильно разведенный продукт (1:100) в течение 1 ч обеспечил инактивацию на 4,9 Log, а более высокие концентрации средства СОПР (разведения 1:10 и 1:50) полностью инактивировали исходный титр вируса, который снизился на 7,0 Log. Аналогичным образом, результаты, полученные в отношении альфа-коронавируса человека hCoV‐229E (Рис. 1C), показывают уровень инактивации 4,9 Log в течение 1 ч контакта при разведении 1:100 и отсутствие остаточного вируса при более высоких концентрациях (−6 Logs). По прошествии более длительного времени (2, 4, 8 и 24 ч) инактивация hCoV‐229E была полной, остаточный вирус не обнаруживался. Система СОПР продемонстрировала аналогичную противовирусную активность также в отношении SARS‐CoV‐2 (Рис. 1D), который в течение 1 ч контакта был инактивирован средством в разведении 1:100 на >4 Log (−4,1 Log). Через 2 и 4 ч после контакта инактивация была полной, поскольку в эти моменты времени остаточный вирус не обнаруживался. Учитывая полученные результаты и по аналогии с тестами в отношении SARS‐CoV‐2, при анализе воздействия на вирусы гриппа тестировали только разведение средств СОПР в соотношении 1:100, используя контактное время 1, 2, 4, 8 и 24 ч. Результаты (Рис. 1E) показывают, что штаммы человека и животных обладают разной чувствительностью к активности средств СОПР, при этом штамм H1N2 свиней оказался наиболее восприимчивым, а штамм H10N1 птиц – наиболее резистентным. Вирус H1N2 свиней был фактически инактивирован средством СОПР в течение 1 ч на >4 Log (−4.4 Log), тогда как штамм H3N2 человека продемонстрировал снижение на 2,5, 3,5 и 4,9 Log, а штамм H10N1 птиц – снижение на 2,1, 3 и 4,5 Log через 1, 2 и 4 ч соответственно.
3.2. Противовирусная активность средств СОПР на поверхности Поскольку в рамках метода испытаний суспензии вирусы вступали в контакт с большим количеством дезинфицирующего средства, что могло облегчить их инактивацию, противовирусную активность средств СОПР также оценивали по методу поверхностных испытаний, которые проводили по стандартной европейской методике UNI EN 16777:2019. С учетом результатов, полученных при испытаниях суспензии, тестирование проводили только с вирусами hCoV‐229E и MVA, чтобы включить в него коронавирус человека, сходный с SARS‐CoV‐2, и высокорезистентный оболочечный вирус. Испытания проводили в трех разных вариантах условий для оценки соответственно: (1) обеззараживающей способности средств СОПР; (2) способности средств СОПР предотвращать вирусное загрязнение; (3) долгосрочного стабильного действия средства СОПР по предотвращению вирусного загрязнения. Результаты испытаний по оценке обеззараживающего действия показывают, что, аналогично результатам испытаний суспензии, любое разведение средств СОПР способно полностью инактивировать hCoV‐229E (снижение >4 Log) в течение 1 ч, тогда как MVA полностью инактивируется в течение 1 ч разведениями 1:10 и 1:50 и в течение 2 ч средством СОПР в разведении 1:100 (Рис. 2). При этом самая низкая концентрация средства СОПР в течение 1 ч привела к снижению титра MVA на 2.5 Log.
Титр вируса (Log10 TCID50/мл) Время контакта (ч) A) hCoV-229E B) MVA Рис. 2. Активность средств СОПР в испытаниях поверхностного обеззараживания. При тестировании указанные разведения средства СОПР (1:10, 1:50 и 1:100) наносили на поверхности, предварительно инфицированные указанными вирусами. Через 1, 2, 4, 8 и 24 ч проводили отбор проб и определяли остаточный титр вируса по методу Спирмена–Кербера. Для контроля использовали 70 % EtOH; результаты выражены как Log10 TCID50/мл и представлены как среднее значение ± стандартное отклонение для параллельных проб в трех независимых испытаниях. (A) Результаты для hCoV‐229E. (B) Результаты для MVA.
Далее оценивали способность поверхностей, обработанных по системе СОПР, предотвратить их последующее вирусное загрязнение. Для этого сначала на поверхность наносили средство СОПР и оставляли сохнуть, затем обработанную поверхность инфицировали инокулятом вируса, остаточный титр которого определяли через 1, 2, 4, 8 и 24 ч контакта. Результаты, в сводном виде представленные на Рис. 3, показывают, что поверхности, обработанные по системе СОПР, способны инактивировать последующее вирусное загрязнение, обеспечивая полную инактивацию hCoV‐229E в течение 1 ч при любом разведении средства СОПР; MVA был полностью инактивирован в течение 1 ч средством СОПР в разведениях 1:10 и 1:50
Титр вируса (Log10 TCID50/мл) Время контакта A) hCoV-229E B) MVA Рис. 3. Способность средств СОПР предотвратить вирусное загрязнение на обработанной поверхности. При тестировании средство СОПР (разведения 1:10, 1:50 и 1:100) наносили на поверхность, оставляли сохнуть и сразу же после этого инфицировали обработанные поверхности указанными вирусами. Через 1, 2, 4, 8 и 24 ч проводили отбор проб и определяли остаточный титр вируса по методу Спирмена–Кербера. Для контроля использовали 70 % EtOH; результаты выражены как Log10 TCID50/мл и представлены как среднее значение ± стандартное отклонение для параллельных проб в трех независимых испытаниях. (A) Результаты для hCoV‐229E. (B) Результаты для MVA.
В заключение оценивали долгосрочную способность средств СОПР предотвратить вирусное загрязнение на поверхностях. Средство СОПР (в разведениях 1:10, 1:50 и 1:100) наносили на поверхности и оставляли сохнуть, затем, через 1, 2, 4, 8 и 24 ч, на обработанные поверхности добавляли вирусные инокуляты. Вирусы оставляли на 2 ч, а затем собирали для определения остаточного титра вирусов (Рис. 4).
Титр вируса (Log10 TCID50/мл) Время после обработки A) hCoV-229E B) MVA Рис. 4. Долгосрочная способность средств СОПР предотвращать вирусное загрязнение на обработанной поверхности. При тестировании средство СОПР (разведения 1:10, 1:50 и 1:100) наносили на поверхность, высушивали и оставляли на поверхности на 1, 2, 4, 8 и 24 ч. После этого обработанные поверхности инфицировали указанными вирусами. Через 2 ч проводили отбор проб и определяли остаточный титр вируса по методу Спирмена–Кербера. Для контроля использовали 70 % EtOH; результаты выражены как Log10 TCID50/мл и представлены как среднее значение ± стандартное отклонение для параллельных проб в трех независимых испытаниях. (A) Результаты для hCoV‐229E. (B) Результаты для MVA.
Примечательно, что поверхности, обработанные средствами СОПР, полностью инактивировали оба вируса даже через 24 ч после обработки, тогда как поверхности, обработанные EtOH и NaClO, с течением времени не сохранили свою инактивирующую способность. EtOH утратил свое инактивирующее действие через 1 ч, а вирулицидное действие NaClO через 2 ч стало постепенно снижаться в отношении как MVA (−2,25 Log через 2 ч), так и hCoV‐229E (−3,4 Logs): в эти моменты времени активность NaClO фактически оказалась ниже порогового значения, необходимого для того, чтобы соединение считалось вирулицидным (−4 Log). По прошествии более длительного времени противовирусная активность обоих химических дезинфектантов полностью исчезла.
3.3. Ферментативная активность пробиотиков в составе средств СОПР Для выяснения возможного вклада пробиотиков в инактивацию вирусов штаммы Bacillus, выделенные из средств СОПР, проанализировали на их ферментативную активность, чтобы выявить любое возможное продуцирование ферментов, способных разрушать вирусные компоненты. Три вида Bacillus (B. subtilis, B. pumilus и B. megaterium), входящих в состав моющих средств СОПР, были по отдельности протестированы по системе API‐ZYM, позволяющей идентифицировать и количественно оценить одновременно 19 разных видов ферментативной активности. Результаты, в сводном виде представленные в Табл. 2, показывают, что каждый вид пробиотических микроорганизмов обладает несколькими видами ферментативной активности, включая щелочную и кислую фосфатазу эстеразу и эстеразную липазу, лейциновую и валиновую ариламидазу (B. pumilus и B. megaterium), α‑химотрипсин (B. pumilus и B. megaterium), нафтол-AS-BI-фосфогидролазу, α‑ и β‑галактозидазу (которой не обладают соответственно B. megaterium и B. subtilis), α‑ и β‑глюкозидазу, N‐ацетил-β‐D-глюкозамидазу и α‑маннозидазу (только B. pumilus). Присутствие ферментов, способных перерабатывать жиры, белки и сахара, подтверждает гипотезу о том, что такие пробиотические микроорганизмы могут химически разрушать внешние слои оболочечных вирусов, обеспечивая их инактивацию.
Таблица 2. Ферментативная активность штаммов Bacillus, содержащихся в средствах СОПР (*).
(*) Активность каждого фермента выражена в баллах от 0 до 5 в зависимости от интенсивности реакции по сравнению с контролем, как указано в инструкциях производителя.
4. Обсуждение результатов Пандемия COVID‐19, вызванная SARS‐CoV‐2, глубоко повлияла на процедуры обеззараживания и повлекла за собой массовое использование дезинфицирующих средств, предписанное для профилактики распространения вируса. С другой стороны, сообщалось о подтвержденном загрязнении рядом других вирусов помимо SARS‐CoV‐2 [33], которые, возможно, способствовали возникновению вирусных инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП) [32], включая оболочечные и безоболочечные вирусы, являющиеся возбудителями респираторных, кожно-слизистых, передающихся с кровью и детских заболеваний [32,54]. Во время пандемии COVID‐19 очень резко возросло использование химических дезинфицирующих средств, применяемых для борьбы с распространением SARS‐CoV‐2 [3,40] [3,40,41,55,56], и были предложены новые системы дезинфекции [57]. Однако некоторые эффективные химические дезинфектанты могут быть токсичными для человека и должны применяться только в отсутствие людей [58], и даже при оптимальных методах очистки и дезинфекции окружающая среда и оборудование быстро загрязняются вновь из-за временного действия дезинфицирующих средств, которое, в итоге, делает возможным повторное загрязнение [16,59,60]. Кроме того, как указывала ВОЗ в недавней редакционной статье [61], наблюдаемое в настоящее время массовое использование химических дезинфектантов может усугубить как загрязнение окружающей среды, так и проблему УПП [24,62,63]. Напротив, как мы недавно сообщали, метод обеззараживания, основанный на принципе микробиомного баланса (система очистки пробиотиками, СОПР), мог бы обеспечить стабильную и эффективную нейтрализацию болезнетворных микроорганизмов по сравнению с химическими дезинфицирующими средствами благодаря механизмам «конкурентного исключения» [64]. Этот метод позволяет уменьшить количество патогенов на 80 % больше, чем химические дезинфицирующие средства [16,22,47,65], и при этом отбор резистентных микроорганизмов не происходит, а существующая УПП даже уменьшается до 99,9 % [46,48,66], как уменьшается число случаев ИСМП (−52 %) и связанное с ними потребление лекарственных средств (−65 %) [46]. Исходя из вышесказанного и учитывая нынешнюю чрезвычайную ситуацию, связанную с COVID‐19, в данном исследовании мы стремились оценить противовирусный потенциал СОПР в отношении оболочечных вирусов, способных заражать среду в медицинских учреждениях, включая SARS‐CoV‐2. Система СОПР была протестирована по методикам испытаний суспензии и поверхностных испытаний в соответствии с европейскими стандартами UNI EN 14476:2019 и UNI EN 16777:2019. Обе методики предусматривают использование безоболочечных вирусов и только одного оболочечного вируса MVA (т.к. он считается самым резистентным оболочечным вирусом), но поскольку целью нашего исследования был анализ оболочечных вирусов, потенциально способных сохраняться на поверхностях и сходных с SARS-CoV‐2, мы включили в него, помимо MVA, коронавирусы человека hCoV‐229E и SARS‐CoV‐2, вирус герпеса человека HSV‐1 и три штамма вирусов гриппа человека/животных типа А. Были протестированы три разных концентрации средств СОПР, включая более низкую, используемую при текущей уборке (разведение 1:100), и две более высоких концентрации (разведения 1:10 и 1:50), и проведено сравнение их активности с активностью 70 % EtOH и 0,5 % NaClO – двух обычных дезинфицирующих средств, предусмотренных для обеззараживания в период пандемии. В соответствии со стандартными методиками оценки вирулицидных свойств продукта, уменьшение титра вирусов в течение 1 ч на ≥4 Log10 рассматривали как пороговое значение, позволяющее утверждать о противовирусной активности продукта в отношении конкретного вируса. Результаты показывают, что средство СОПР было активно на всех оболочечных вирусах при всех разведениях, и его активность менялась во времени. В частности, разведение 1:100 в течение 1 ч полностью инактивировало все тестовые вирусы, кроме MVA, который был инактивирован в течение 2 ч. Неоднозначная ситуация наблюдалась в случае вирусов гриппа, что подтвердило данные, полученные ранее для химических дезинфицирующих средств, которые демонстрировали разную активность в зависимости от вида и хозяина вируса [67]. Действительно, средство СОПР в разведении 1:100 инактивировало вирус свиней в течение 1 ч, а для инактивации вирусов человека и птиц потребовалось 2–4 ч; это означает, что для борьбы с этими штаммами вирусов необходимо использовать более высокие концентрации средств СОПР, чтобы обеспечить инактивацию за более короткое время. Результаты поверхностных испытаний на hCoV‐229E и MVA подтвердили эффективное инактивирующее действие в условиях обеззараживания и профилактики. Интересно отметить, что если 70 % EtOH и 0,5 % NaClO утратили активность в течение 1 и 2 ч соответственно, то поверхности, обработанные по системе СОПР, сохраняли свои противовирусные свойства даже через 24 ч после применения СОПР. Это показывает, что обеззараживание по системе СОПР (в обычном режиме текущей уборки) может обеспечить постоянную стабильную дезинфекцию окружающей среды. Как известно, поверхностно-активные вещества (ПАВ), входящие в состав моющего средства, повреждают и разрушают оболочку вирусов [55,68], и этим, по крайней мере отчасти, может объясняться противовирусное действие СОПР. Однако долгосрочное действие моющего средства на поверхности трудно отнести на счет одних только ПАВ, поэтому мы предположили, что непрерывное действие средств СОПР может объясняться распространяющимися по обработанной поверхности ферментами, которые продуцируют входящие в состав этих средств штаммы Bacillus. Анализ ферментов, продуцируемых тремя видами Bacillus, выделенных из средств СОПР (B. subtilis, B. pumilus и B. megaterium), выявил несколько видов ферментативной активности, потенциально способной разрушать оболочечные компоненты вирусов, включая жиры, белок и сахарные остатки. С этим согласуется тот факт, что, по опубликованным данным, класс Bacillus известен как один из наиболее важных бактериальных источников ферментов, обладающий такими замечательными свойствами, как высокая устойчивость к экстремальным температурам, кислотности, органическим растворителям и оксидантам. Ферменты Bacillus давно используются в медицине, для разрушения биопленок, в животных кормах, сельском хозяйстве, для разложения перьев, шерсти и волос [69,70], что подтверждает их способность также разрушать внешние слои вирусов. Действительно, подобную активность ранее связывали с эффективным 99,9 % снижением микробного загрязнения [71]; это подсказывает, что она может быть значимой и для борьбы с вирусами. Кроме того, бактерии класса Bacillus обладают способностью к спорообразованию, что делает их устойчивыми к жестким условиям окружающей среды и пригодными для использования в концентрированных моющих средствах, обусловливая интерес к ним для медицинских и промышленных целей. Наконец, СОПР – недорогая доступная система, что также важно с точки зрения снижения затрат [72] и открывает возможности для применения этой системы в различных несанитарных условиях, включая школы, офисы, общественный транспорт, а также в странах с низкими доходами. Следует отметить, что стандарт UNI EN 14885:2018 предусматривает два вида дезинфекции в человеческой медицине: быструю (в течение 5 мин) для критических зон работы с пациентами и медленную (в течение 1 ч) для других зон [73]. СОПР обеспечивает медленную дезинфекцию, однако сохраняющаяся в течение 24 ч стабильная обеззараживающая активность этой системы показывает, что она способна надолго защитить обработанную среду. Это актуально, учитывая недавние утверждения Центров по контролю и профилактике заболеваний США о том, что, при отсутствии людей с подтвержденным/предполагаемым COVID‐19, ежедневной уборки может быть достаточно для удаления вирусов с поверхностей и поддержания здоровой окружающей среды в помещении [19]. Однако для объектов, не относящихся к медицинским учреждениям, было бы также уместно проверить эффективность СОПР в присутствии высокой органической нагрузки (в «грязных» условиях), т.к. в несанитарных условиях может быть больше органических веществ, чем в больничных. Кроме того, все более серьезную проблему представляет сухая биопленка на поверхностях, поэтому было бы интересно изучить воздействие СОПР на это микробное сообщество. И наконец, было бы интересно распространить анализ также на безоболочечные вирусы, чтобы оценить возможное противовирусное действие в отношении этих более резистентных вирусов.
5. Заключение Учитывая эффективную долгосрочную противовирусную активность и характеристики устойчивости средств СОПР, обеззараживание по этой системе можно считать новой и безопасной концепцией контроля и профилактики распространения различных оболочечных вирусов, в том числе SARS‐CoV‐2, также ввиду отсутствия негативных побочных воздействий на здоровье окружающей среды и проблему УПП.
Дополнительные материалы. По адресу www.mdpi.com/1999‐4915/13/11/2227/s1 доступен онлайн Рис. S1: Репрезентативные изображения контрольных и зараженных клеток, инокулированных остаточным вирусом, через 1 и 24 ч контакта со средствами СОПР в указанных разведениях. Вклад авторов. Концептуальная проработка – Э.К.; методология – Э.К., Ф.Б. и С.М.; проверка достоверности – Ф.Б., В.Р. и С.М.; формальный анализ – Э.К.; исследование – М.Д. и И.С.; ресурсы – С.М.; курирование данных – В.Р.; написание текста – подготовка первоначального варианта статьи – Э.К.; написание текста – проверка и редактирование статьи – Э.К. и В.Р. Все авторы прочитали публикацию и согласились с опубликованной версией рукописи. Финансирование. Данное исследование было поддержано средствами оперативной программы Европейского фонда регионального развития региона Эмилия–Романья (грант № PG/2020/362659, «Поддержка исследовательских и инновационных проектов по разработке решений, направленных на борьбу с эпидемией COVID-19» (“Bando per sostenere progetti di ricerca ed innovazione per lo sviluppo di soluzioni finalizzate al contrasto dell’epidemia da COVID‐19”); Эмилия–Романья, Италия). Заявление комиссии по медицинской этике. Не применимо. Заявление об информируемом согласии. Не применимо. Заявление о доступности данных. Все данные, представленные в настоящем исследовании, содержатся в статье или в дополнительных материалах к ней. Благодарности. Авторы выражают благодарность Институту вирусологии и иммунологии Бернского университета (Швейцария) за предоставление вируса SARS‐CoV‐2. Авторы также выражаем благодарность Франческе Бини и Элеоноре Мадзине за отличную техническую помощь. Конфликт интересов: Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов.
|
| Технология «Сайт-Менеджер » |